Uji Aktifitas Senyawa Hasil Oksidasi Kariofilena dengan KMnO4 terhadap Jamur Candida albicans

A. JUDUL PROGRAM
Uji Aktifitas Senyawa Hasil Oksidasi Kariofilena dengan KMnO4 terhadap Jamur Candida albicans

B. LATAR BELAKANG MASALAH
Candida albicans (C. albicans) merupakan salah satu organisme komensal yang bertindak sebagai flora normal pada tubuh manusia dan tidak berbahaya. Namun, C. albicans juga merupakan jamur yang paling banyak menyebabkan infeksi pada manusia. Infeksinya biasanya bersifat lokal seperti infeksi oral dan vaginal. Pada pasien-pasien penderita immunocompromise, seperti bayi yang lahir prematur, penderita luka bakar, leukemia, dan pasien-pasien penderita penyakit imunodefisiensi seperti AIDS, infeksi Candida dapat bersifat menyeluruh dan berakibat fatal, yang mana lebih dari 50% pasien immunocompromise dan imunodefisiensi meninggal akibat infeksi yang disebabkan oleh Candida (Riskillah 2010).
Adanya organisme yang termasuk genus Candida dalam tubuh dikenal sebagai kandidiasis atau kandidosis. Tempat yang paling umum terdapat Candida sp. adalah mulut, saluran anorektal, saluran kelamin dan kuku. Hampir 85-90% jamur yang terdapat pada vagina adalah strain Candida albicans. Organisme kandida bersifat dimorfi dan terdapat pada manusia dalam berbagai fasa fenotip. Cara penularan terutama adalah kontak langsung orang ke orang, khususnya pada kelompok aktif seksual (Herman 2001).
Pengobatan pada infeksi oleh jamur Candida biasanya dimulai dengan menghindari atau menghilangkan faktor-faktor predisposisi sebelum pemberian pengobatan secara medikamantosa (Riskillah 2010). Menurut Tietz (2010), terapi obat yang umum digunakan dalam pengobatan kandidiasis vagina adalah Clotrimazole, nystatin, fluconazole, posaconazole, atau siklopiroxolamin. Al-Attas (2010) mengemukakan bahwa pengobatan kandidiasis pada penderita DM (diabetes melitus) menggunakan senyawa azol seperti fluconazol, ketokonazol, econazol dan mikonazol menunjukkan gejala resistensi terhadap jamur Candida. Pengobatan medikamentosa memang memberikan hasil yang cukup memuaskan, tetapi adanya efek samping obat seperti demam, muntah, spasme otot, dan hipotensi dapat menyebabkan kegagalan terapi, dikarenakan keengganan untuk meneruskan terapi tersebut.
Pengobatan tradisional merupakan salah satu alternatif yang mungkin dapat dipilih masyarakat yang enggan menggunakan pengobatan medikamentosa dengan obat-obat sintetis, sehingga diperlukan adanya penelitian tentang obat tradisional sebagai antijamur Candida albicans.
Berdasarkan hasil penelitian Fu, et al (2007), minyak cengkeh memiliki daya antifungi terhadap Candida albicans. Aktifitas antifungi Candida albicans pada minyak cengkeh diperkirakan berasal dari senyawa kariofilena sebagai kandidisida (Duke dalam Hertiani dan Purwantini 2002: 194). Penelitian sejenis pada tanaman-tanaman yang mengandung senyawa kariofilena seperti yang dilakukan oleh Goren (2004) terhadap Satureja thymbra, Wang (2006) terhadap Ambrosia trifida L. dan Azaz et al (2002) terhadap S.coerulea ternyata juga memiliki aktifitas sebagai anti kandida

C. PERUMUSAN MASALAH
Senyawa kariofilena merupakan senyawa seskuiterpen utama minyak cengkeh yang mana biosintesisnya berasal dari 2-cis farnesil pirofosfat (atau melalui nerolidil pirofosfat dengan cara yang berbeda) (Herbert 1989:86). Kariofilena yang terdapat dalam minyak cengkeh hanya memiliki dua isomer yaitu humulena (α-kariofilena) dan kariofilena (Guenther 1990).
Penelitian Duke dalam Hertiani dan Purwantini (2002: 194) menyatakan bahwa senyawa kariofilena dalam minyak cengkeh berperan sebagai kandidisida. Penelitian sejenis pada tanaman-tanaman yang mengandung senyawa kariofilena seperti yang dilakukan oleh Goren (2004) terhadap Satureja thymbra, Wang (2006) terhadap Ambrosia trifida L. dan Azaz et al (2002) terhadap S.coerulea ternyata juga memiliki aktifitas sebagai anti kandida. Berdasarkan uraian tersebut, maka dapat dibatasi permasalahan dalam penelitian ini sebagai berikut:
Apakah senyawa hasil oksidasi kariofilena dapat menjadi alternatif pengobatan infeksi Candida albicans?.
Hipotesis dalam penelitian ini adalah “senyawa hasil oksidasi kariofilena dapat menjadi alternatif pengobatan infeksi Candida albicans”.

D. TUJUAN PROGRAM
Tujuan program ini adalah melakukan penelitian yang mendalam tentang senyawa kariofilena sebagai antijamur Candida albicans dengan mengoksidasi senyawa tersebut menggunakan KMnO4. Senyawa kariofilena telah diketahui mempunyai kemampuan sebagai antijamur Candida albicans, sehingga pengembangan senyawa tersebut untuk dijadikan sebagai alternatif pengobatan sangatlah potensial.
Dengan diketemukannya senyawa baru sebagai antijamur Candida albicans diharapkan pengobatan infeksi jamur Candida albicans dapat berjalan lebih aman tanpa efek samping yang merugikan kesehatan.

E. LUARAN YANG DIHARAPKAN
Luaran yang dihasilkan dari program ini adalah:
1. Dihasilkan suatu senyawa baru sebagai alternatif pengobatan terhadap infeksi Candida albicans yang aman tanpa efek samping.
2. Meningkatkan manfaat senyawa kariofilena yang merupakan hasil samping dari destilasi minyak cengkeh yang relatif banyak jumlahnya dan murah.

F. KEGUNAAN PROGRAM
Program ini bermanfaat pada beberapa segi, yaitu:
1. Manfaat dari segi IPTEK
Pengembangan potensi senyawa kariofilena melalui reaksi oksidasi dengan KMnO4. Adanya ikatan rangkap pada senyawa kariofilena memungkinkan untuk dilakukannya berbagai reaksi pada senyawa tersebut.
2. Manfaat dari segi Kesehatan
Pengembangan potensi senyawa hasil oksidasi kariofilena sebagai antijamur Candida albicans. Pengembangan antijamur ini cukup prospektif. Hal tersebut tidak dapat dipungkiri karena Indonesia beriklim tropis, sehingga memungkinkan jamur parasit untuk tumbuh dengan baik. Tentu saja kemungkinan terjadinya infeksi oleh Candida albicans juga akan meningkat. Namun, selama ini pengobatan dengan obat-obat sintetis belum memberikan hasil yang memuaskan dan cenderung memberikan sejumlah efek samping. Oleh sebab itu, diperlukan suatu obat antijamur yang aman tanpa adanya efek samping yang merugikan kesehatan.
Dengan dilakukannya penelitian dan pengembangan yang mendalam tentang senyawa kariofilena ini, maka diharapkan akan diperoleh senyawa baru yang relatif aman digunakan, sehingga tren penggunaan obat akan bergeser ke arah obat-obat tradisional.

G. LANDASAN TEORI
G.1 SENYAWA KARIOFILENA
Minyak cengkeh adalah minyak mudah menguap (atsiri) yang diperoleh melalui destilasi bunga, batang, dan daun pohon cengkeh. Minyak cengkeh mengandung komponen utama yaitu senyawa eugenol, eugenol asetat, kariofilena dan senyawa metil-n-amil keton. Beberapa penggunaan minyak cengkeh adalah sebagai pemberi rasa makanan, parfum, sabun, dan digunakan pada industri farmasi karena sifatnya sebagai antiseptik dan bakterisidal (Guenther 1990).
Senyawa kariofilena merupakan senyawa seskuiterpena yang mana biosintesisnya diperkirakan berasal dari 2-cis farnesil pirofosfat (atau melalui nerolidil pirofosfat dengan cara yang berbeda) (Herbert 1989: 86).




Gambar 1. Biosintesis Kariofilena
Berdasarkan struktur kariofilena seperti tersebut di atas, di mana kariofilena memiliki ikatan rangkap pada C-4 sebagai ikatan rangkap endosiklik dan C-8 sebagai ikatan rangkap eksosiklik, Sudarmin (2005) melakukan reaksi hidrasi OM-DM pelarut THF-Air terhadap kariofilena membentuk senyawa hidroksi merkuri pada atom C rangkapnya. Selanjutnya senyawa hidroksi merkuri asetat direduksi NaBH4 dalam larutan NaOH menghasilkan kariolanol. Perkiraan mekanisme reaksi dari kariofilena dengan pereaksi OM-DM pelarut THF-Air jika mengikuti hukum Markovnikov maka hidrasi akan terjadi pada ikatan rangkap trisubtitusi yang terletak pada posisi C-8 (endosiklik). Prakiraan untuk reaksi oksimerkurasi-demerkurasi kariofilena sebagai berikut.





Gambar 2. Reaksi oksimerkurasi-demerkurasi kariofilena
Fessenden (1986: 395) mengemukakan bahwa reaksi oksimerkurasi-demerkurasi pada senyawa alkena akan menghasilkan senyawa alkohol tanpa penataulangan produk. Sintesis senyawa kariofilena alkohol oleh Sudarmin (2001) dan Siadi (2007) menggunakan kalium permanganat menghasilkan kariolanol yang mengalami reaksi penataan ulang pada strukturnya dan dihasilkan klovanadiol sebagai hasil akhir reaksi oksidasi kariofilena.







Gambar 3. Reaksi penataan ulang Kariolanol menjadi Klovanadiol
Sedangkan Kadarohman (2000) melakukan sintesis klovanadiol secara selektif dari kariofilena dengan melalui tahap reaksi epoksidasi kariofilena, esterfikasi kariofilena oksida dan hidrolisis ester.

G.2 REAKSI OKSIDASI PADA SENYAWA ALKENA
Reaksi oksidasi pada kimia organik dapat berupa eliminasi hidrogen seperti pada serangkaian dehidrogenasi etana atau penggantian atom hidrogen yang terikat pada karbon dengan unsur lain yang lebih elektronegatif seperti oksigen. Oksidasi dapat juga didefinisikan sebagai reaksi suatu unsur dengan oksigen.
Permanganat (MnO4-) berfungsi sebagai oksidator yang kuat dalam media basa, asam, dan netral. Dalam larutan asam, permanganat memiliki potensial reduksi 1,679 atau 1,491 volt, sedangkan dalam larutan basa potensial reduksinya 0,588 volt sesuai dengan reaksi:
MnO4- + 4 H+ + 3 e  MnO2 + 2H2O 1,679 volt
MnO4- + 8 H+ + 5 e  Mn2+ + 4H2O 1,491 volt
MnO4- + 2H2O + 3 e  MnO2 + 4 OH- 1,491 volt
Pada dasarnya, kalium permanganat dapat digunakan untuk mengoksidasi alkena menjadi alkana diol. Alkena dapat memberikan pasangan elektron ke pusat elektrofilik. Jika reaksi dengan alkena dipandang sebagai proses bertahap, alkena akan memberikan elektron ke dipol. Proses ini akan menghasilkan ester manganat siklik. Pembentukan ester manganat siklik disertai dengan reduksi Mn (VII) menjadi Mn (V). Hasil ini kemudian terurai menjadi alkana diol.







Gambar 4. Reaksi pembentukan alkana diol
Reaksi permanganat dengan alkena merupakan proses eksotermis. Pada keadaan encer, permanganat mengoksidasi alkena menjadi alkana diol dengan hasil yang sangat baik. Bila reaksi dijalankan pada suhu yang relatif tinggi dan dengan adanya larutan kalium permanganat pekat, umumnya dalam media asam maka alkena terputus menjadi diasam melalui oksidasi intermediet diol. Pengertian keadaan oksidasi suhu tinggi dan pekat adalah konsentrasi kalium permanganat mempunyai kisaran dari > 10 % hingga 10 M, dan suhu berkisar pada suhu kamar hingga lebih tinggi dari 1000C (Sastrohamidjojo dan Pranowo 2009: 76-111).
Oksidasi kariofilena dengan KMnO4 menjadi kariofilena diol diperkirakan mengikuti mekanisme reaksi yang sama dengan oksidasi alkena pada umumnya.






Gambar 5. Reaksi pembentukan Karofilena diol

G3. KANDIDIASIS
Candida albicans (C. albicans) merupakan salah satu organisme komensal yang bertindak sebagai flora normal pada tubuh manusia dan tidak berbahaya. Namun, C. albicans juga merupakan jamur yang paling banyak menyebabkan infeksi pada manusia. Infeksinya biasanya bersifat lokal seperti infeksi oral dan vaginal. Pada pasien-pasien penderita immunocompromise, seperti bayi yang lahir prematur, penderita luka bakar, leukemia, dan pasien-pasien penderita penyakit imunodefisiensi seperti AIDS, infeksi Candida dapat bersifat menyeluruh dan berakibat fatal, yang mana lebih dari 50% pasien immunocompromise dan imunodefisiensi meninggal akibat infeksi yang disebabkan oleh Candida (Riskillah 2010).
a. Epidemiologi
Adanya organisme yang termasuk genus Candida dalam/pada badan dikenal sebagai kandidiasis atau kandidosis. Sebagian besar kandidiasis oral diamati pada awal kelahiran, dalam kondisi sakit, dan masa pertumbuhan. Karena panjang dan lamanya terapi, maka pengobatan dilanjutkan dengan antibiotik spektrum luas. Pada penderita diabetes, kandidiasis akan menjadi lebih parah karena proses pengobatan akan lebih sulit dan lama.
Infeksi C. albicans bersifat endogen. Oleh karena itu, tempat yang paling umum terdapat Candida sp. adalah mulut, saluran anorektal, dan saluran kelamin (Dubey 2004: 481-483).
Organisme kandida bersifat dimorfi dan terdapat pada manusia dalam berbagai fasa fenotip. Hampir 85-90% jamur yang terdapat pada vagina adalah strain Candida albicans dan Torulopsis glabrata. Vaginitis kandida terutama menonjol pada wanita usia subur khususnya pada status sosioekonomi rendah dan selama kehamilan (Herman 2001).
b. Jenis Klinis
Beberapa jenis infeksi C. albicans adalah kandidiasis oral, bronchocandidiasis, kandidiasis paru, endokarditis, dan meningitis (Dubey 2004: 482).
c. Karakteristik Kultur
Candida albicans berbentuk bulat kecil seperti jamur ragi dan berukuran 2.5x4x6 µm. Sel memanjang dan berkembang melalui pseudomycelium (Dubey 2004: 482).

H. METODE PENELITIAN
H.1 WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Program ini akan dilaksanakan di laboratorium Kimia Organik Universitas Negeri Semarang selama 4 bulan.



H.2 VARIABEL PENELITIAN
Variabel dalam penelitian adalah:
1. Variabel bebas adalah variabel yang menjadi titik pusat penelitian. Variabel terikat pada penelitian ini adalah daya antijamur Candida senyawa hasil oksidasi kariofilena.
2. Variabel terikat adalah variabel yang akan diteliti pengaruhnya terhadap variabel terikat. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi zat uji (hasil oksidasi kariofilena dan kariofilena).
3. Variabel terkendali adalah faktor-faktor lain yang tidak dapat mempengaruhi hasil selama penelitian: suhu dan waktu

H.3 MODEL YANG DIGUNAKAN
Pada penelitian ini, akan dilakukan oksidasi Senyawa kariofilena dengan larutan KMnO4 0,5 M pada suasana asam. Suhu reaksi dijaga konstan pada 00 C -100 C dan reaksi dilakukan selama 0,5 jam.
Campuran fasa organik yang diperoleh kemudian disaring dan dievaporasi. Hasil oksidasi (fasa organik) dianalisis struktur dengan IR dan analisis kadar dengan GC-MS. Hasil oksidasi yng diperoleh kemudian digunakan sebagai zat uji antijamur Candida albicans dengan metode cakram (disc diffusion).

H.4 RANCANGAN PENELITIAN
H.4.1 ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN
Peralatan yang digunakan:

1. Alat destilasi bertekanan
2. Refluks 250 ml
3. Hot plate magnetic stirrer
4. Evaporator
5. Autoclave
6. Neraca digital
7. Peralatan gelas standar lab.
8. Instrumen FTIR
9. Instrumen GC-MS
10. Inkubator



Bahan yang digunakan:

1. Kariofilena
2. Benzene
3. Larutan KMnO4 0,5M
4. Katalis transfer fasa CTAB
5. H2SO4 pekat
6. Na2SO4 anhidrat
7. Aseton
8. Media SDA (Sabouroud Dextrose Agar)
9. Eter
10. Kertas Whattman
11. Jamur Candida albicans
12. Aquadest



H.4.2 METODE PENELITIAN
Penelitian ini terdiri dari 3 tahap, yaitu: 1. Isolasi kariofilena, 2. Oksidasi kariofilena, dan 3. Uji antikandida.
Tahap 1: Isolasi Kariofilena
Tahap isolasi dimulai dengan melakukan destilasi fraksinasi pengurangan tekanan, kemudian hasil destilasi diuji struktur menggunakan FTIR dan diuji jumlah komponen menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa atau KG-MS. Sebanyak 500 ml kariofilena hasil samping isolasi eugenol diredestilasi menggunakan destilasi fraksinasi agar diperoleh hasil dengan kemurnian tinggi. Hasil destilasi kemudian dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat dan dilakukan pengujian struktur dengan FTIR dan pengujian jumlah komponen dengan kromatografi gas-spektroskopi massa (KG-MS).
Tahap 2: Oksidasi Kariofilena
Senyawa kariofilena sebanyak 20 ml dimasukkan dalam labu alas bulat leher tiga 250 ml yang sudah dilengkapi termometer, pendingin bola, dan magnetik stirrer, kemudian ditambah benzena sebanyak 40 ml. Campuran diaduk selama 15 menit kemudian ditambah larutan KMnO4 0,5 M sebanyak 20 ml tetes demi tetes. Suhu dijaga konstan pada 00 C -100 C. Sebanyak 1 ml H2SO4 pekat dimasukkan ke dalam campuran tetes demi tetes. Campuran ditambah CTAB (0,05 g dalam 10 ml aseton) sedikit demi sedikit. Reaksi dilakukan selama 0,5 jam-1jam, kemudian setelah dicapai waktu yang diinginkan hasil reaksi dibiarkan selama 1 malam. Setelah didiamkan 1 malam maka akan terbentuk 2 lapisan, yang mana lapisan atas adalah fasa organik dan lapisan bawah adalah fasa air. Kedua lapisan dipisahkan dengan corong pisah. Fasa air yang diperoleh pada tahap tersebut diekstrak dengan pelarut eter untuk mendapatkan fasa organik yang masih tertinggal. Fasa organik tersebut dicampur dengan fasa organik yang diperoleh pada tahap pemisahan pertama, kemudian dicuci dengan asetaldehid untuk menjernihkan, disaring dan dicuci dengan aquadest hingga netral (pH 7). Aquadest yang tercampur dengan fasa organik dipisahkan dengan corong pisah, sisa air yang masih ada dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat sehingga diperoleh fasa organik bebas air.
Campuran fasa organik kemudian disaring dan dievaporasi. Hasil oksidasi (fasa organik) dianalisis struktur dengan IR dan analisis kadar dengan GC-MS.
Tahap 3: Uji Antikandida
a. Pembuatan media
Sebanyak 19,5 gram serbuk SDA dilarutkan dalam 300 ml air suling steril yang sebelumnya telah dipanaskan. Setelah larut dimasukan ke dalam Erlenmeyer, disumbat dengan kapas berlemak dan aluminium Foil, kemudian disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C
b. Penyiapan jamur
1 ose biakan jamur Candida albicans murni dimasukkan ke dalam 10 mL medium SDA secara aseptis, digojog dan diinkubasi dengan menggunakan inkubator pada suhu kamar selama 24 jam. Kemudian melakukan pengenceran 1 mL dari medium SDA dimasukkan ke dalam 9 mL aquadest steril, sehingga didapatkan pengenceran 10-1 sebagai sumber bakteri.
c. Uji antikandida
Medium Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) yang akan digunakan sebagai medium pertumbuhan jamur Candida albicans disediakan dengan cara memanaskan Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) kembali, kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril secara aseptis. Jamur Candida albicans ditanam pada medium Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) dengan cara memasukkan 1 mL biakan jamur hasil pengenceran ke dalam medium Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) kemudian menggoyangkan seperti angka 8. Cakram Whatmann dicelupkan dalam hasil oksidasi kariofilena pada konsentrasi yang telah ditentukan selama 20 menit agar hasil oksidasi kariofilena bisa meresap ke dalam cakram Whatmann tersebut, kemudian diangin-anginkan dan diletakkan pada medium Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) yang telah ditanami jamur Candida albicans. Seluruh cawan petri yang berisi pembenihan jamur Candida albicans diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar, kemudian diamati dan diukur daerah hambat pertumbuhan jamur di sekitar cakram, dilanjutkan dengan menghitung luas daerah hambat/zona beningnya.

H.5 TEKNIK PENGUMPULAN DAN ANALISA DATA
Dalam penelitian ini, data dikumpulkan dari hasil oksidasi senyawa kariofilena yang kemudian dianalisis struktur dengan IR dan analisis kadar dengan GC-MS.
Senyawa hasil oksidasi kariofilena digunakan sebagai zat uji antijamur Candida albicans. Data penelitian berupa luas daerah hambat pertumbuhan jamur Candida albicans yang diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.

H.6 CARA PENAFSIRAN DAN PENYIMPULAN HASIL PENELITIAN
Analisis dilakukan dengan metode spektroskopi infra merah dan spektroskopi massa yang digabungkan dengan kromatografi gas (KG-MS). Analisis spektroskopi infra merah dilakukan untuk mengetahui lebih lengkap tentang gugus-gugus fungsi lain yang terdapat dalam senyawa tersebut, dan metoda spektroskopi massa untuk mengetahui bobot molekul senyawa kariofilena dan hasil oksidasinya serta pola fragmentasinya yang akan membimbing ke struktur senyawa tersebut.
Seluruh cawan petri yang berisi pembenihan jamur Candida albicans diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar, kemudian diamati dan diukur daerah hambat pertumbuhan jamur di sekitar cakram, dilanjutkan dengan menghitung luas daerah hambat/zona beningnya.Zona bening di sekeliling senyawa yang diuji aktivitasnya menunjukan hambatan pertumbuhan jamur Candida albicans yang diamati dan diukur.


Gambar 6. Pengukuran Zona Bening